MOLEKÜLER SİTOGENETİK

Sitogenetik, kromozomların sayısal ve yapısal durumunun ve kalıtımdaki rollerinin incelenmesidir. Klasik sitogenetik yöntemlerle tanımlanamayan kromozomal mikrodelesyonlar ve translokasyonlar gibi yapısal bozukluklar ve kromozomlardaki sayısal anormallikler moleküler sitogenetik yöntemlerle tanımlanabilmektedir. Fluorescence In Situ Hybridization (FISH), array Comparative Genomic Hybridization(aCGH) ve Next Generation Sequencing (NGS) yaygın olarak kullanılan moleküler sitogenetik yöntemlerdir. 

İncelenecek kromozom bölgesinin varlığını veya yokluğunu ya da sayısını değerlendirmek için FISH tekniği kullanılmaktadır. Kromozomlar amaca göre farklı bölgelerinden prob adı verilen özel floresan boyalarla işaretlenip incelenmektedirler. FISH yöntemi ile bir seferde 5, iki seferde toplam 9 kromozom (13, 16, 18, 21, 22 ve 15, 17, X, Y) incelenebilmektedir. Ancak 23 çift kromozomun tümü değerlendirilemediği için etkinliği yetersizdir. Güncel uygulamalarda embriyolarda tüm kromozomların incelenebildiği PGT yöntemi ile anöploidi tanımlaması yapılmaktadır.

 

FISH Tekniği Merkezimizde Hangi Nedenlerle Uygulanmaktadır?

Translokasyon Taşıyıcısı Çiftlerde (PGT-SR)

Translokasyonlar gibi yapısal kromozomal bozukluk taşıyıcısı olan çiftlerde sağlıklı (normal veya dengeli) bir embriyo bulabilmek amacı ile yapılan preimplantasyon genetik tanı yöntemidir. Translokasyon veya inversiyon taşıyıcılarında bireyler dış görünüş (fenotipik) olarak bir anormallik göstermezler, ancak yumurta ve sperm gibi üreme hücrelerinin oluşumunda kromozomların anormal dağılım göstermelerinden dolayı anormal üreme hücresi (gamet) oluşturma riskleri vardır (şekil 1). Bu durum tekrarlayan gebelik kayıpları, tekrarlayan başarısız tüp bebek (IVF) denemeleri, anomalili fetüs öyküsü gibi olumsuz sonuçlara neden olmaktadır. Merkezimizde embriyolarda kromozomlardaki translokasyon kırık noktalarının özelliklerine göre öncelikle en ileri yöntem olan Next Generation Sequencing (NGS) tekniği ile inceleme yapılmaktadır. Ancak nadir durumlarda kırık noktasının yerleşim yerine göre NGS tekniğine ek olarak FISH tekniği ile normal veya dengeli embriyoların seçilimi gerekebilmektedir. Hangi durumlarda FISH tekniğinin ilave edileceği genetik doktorunuz tarafından belirlenecektir.  
 

                                                   

                              Şekil 1: Normal veya dengeli taşıyıcı ve anormal embriyo oluşma olasılıkları.
 

 

                                     

                                                Şekil 2: Resiprokal Translokasyon, 46,XY, t(4;7)(q35.1;q31.2)

 

Kromozom analizi sonucu Resiprokal Translokasyon saptanan hastalarımızda translokasyon kırık noktalarının yerine göre, gerektiği durumlarda FISH yöntemi uygulanmakta (Şekil 2-7) daha sonra normal veya dengeli olarak bulunan embriyolara NGS tekniği ile tüm kromozomlar için anöploidi taraması yapılmaktadır(Şekil 8). Translokasyonların çok büyük bir çoğunluğu sadece NGS yöntemi kullanılarak tanımlanabilmektedir.
 

                                 

                                                    Şekil 3: 46,XX, t(4;11)(q31.2;q21) Resiprokal translokasyonda, taşıyıcılığın

                                                    FISH yöntemi ile doğrulanması. 11.kromozomun q koluna ait sinyalin

                                                                     4.kromozomun q kolunda olduğu gösterilmiştir.

 

 

                                  

                                                Şekil 4: 46,XY, t(13;18)(q11;q11) Resiprokal Translokasyonda,
                                         translokasyon taşıyıcılığının FISH yöntemi ile doğrulanması. 13.kromozomun
                                               q koluna ait sinyalin 18.kromozomun q kolunda olduğu gösterilmiştir.
 

 

                                                   

                                                     Şekil 5: 46,XY, t(1;16)(q12;q11.2) Resiprokal Translokasyon
                                                                saptanan bireyde translokasyon taşıyıcılığının
                                                                       FISH yöntemi ile doğrulanması

 

                                  

                                            Şekil 6: PGT-SR-FISH yöntemi ile segmental trizomi 18p saptanan
                                                 anormal (dengesiz) embriyo. 18.kromozomun p bölgesine ait
                                                     3 sinyal, 13.kromozomun q koluna ait 1 sinyal alınmıştır.

 

                                  

                                             Şekil 7: NORMAL veya DENGELİ olarak saptanan embriyoya ait
                                                          FISH görüntüsü. Her bir kromozom bölgesine ait
                                                                                ikişer adet sinyal alınmıştır.

 

Translokasyon taşıyıcılığı açısından Normal veya Dengeli olarak saptanan embriyolara daha sonra NGS çalışması yapılarak diğer kromozomlar da sayısal olarak incelenmektedir.

                                        Şekil 8: NGS yöntemi ile Normal veya Dengeli olarak saptanan embriyo görüntüsü 

 

Translokasyonların çok büyük bir kısmı sadece NGS tekniği kullanılarak tanımlanabilmekte FISH tekniği ancak nadiren gerekli olmaktadır (Şekil 9-10).

           Şekil 9: 46,XY,t(2;5)(q21;q33) taşıyıcılığı olan çiftte dengesiz olarak saptanan embriyoya ait NGS Görüntüsü,
                                                                     Segmental (duplikasyon 2q, delesyon 5q)

 

            Şekil 10: 46,XX,t(3;10)(q23;q11.2) taşıyıcılığı olan çiftte dengesiz olarak saptanan embriyoya ait NGS görüntüsü,
                                                                   Segmental (duplikasyon 3q, delesyon 10q )

 

• Translokasyon taşıyıcılığı yanında inversiyon, insersiyon, ring kromozom, marker kromozom gibi bazı özel yeniden düzenlenme gösteren olgularda da kromozom bölgelerine özel belirteçler ile inceleme yapılabilmektedir.

•  Anormal döllenme gösteren embriyolarda NGS işlemi öncesi normal (2n) veya anormal (n,3n, 4n, gibi) kromozom kuruluşlarının belirlenmesinde FISH tekniği kullanılır.  Normal bulunanlarda NGS işlemine devam edilerek embriyolar anöploidi yönünden incelenmektedir. Tüm kromozomlarda meydana gelebilecek ve çok nadir olarak görülen triploidi (3n) ve tetraploidi (4n) gibi eşit orandaki anormal sayı artışlarının tanımlanması NGS tekniği ile mümkün olmadığından FISH ile ayrım yapılması gerekebilir.

 
Sperm-FISH Testi Nedir? Kimlere Uygulanır?

• Gebelik kayıplarına ve anormal doğumlara sebep olabilen kromozomal anormalliklerin erkekten kaynaklanan önemli bir bölümü sperm yapım aşamasındayken ‘de novo’ yani yeni oluşum olarak gerçekleşir. Anormal durumlarda, sperm bir kromozomu fazla ya da eksik taşıyor olabilir (anöploid), veya bir extra bir kromozom seti taşıyor olabilir (diploid). Sperme ait kromozomal anormallikleri belirleyebilmek için sperm FISH işlemi uygulanır.

• Anöploidi oranlarını belirleyebilmek için 2 farklı prob seti kullanılarak, anormalliklerin sıklıkla görüldüğü 13, 18, 21, X ve Y kromozomları incelenir.

                                                    

                                                 Şekil 11: 18,X ve 18,Y kromozomu taşıyan, normal spermler

Normal bir sperm hücresinde her bir kromozomdan 1 adet bulunmaktadır.  Bunun dışındaki sayılar anormal olarak değerlendirilir (şekil 11-12).

 

                                    

                                  Şekil 12: 13,21 taşıyan normal (üstte) ve 21 dizomisi taşıyan anormal sperm (altta)
 

• Nedeni açıklanamayan infertilite, tekrarlayan gebelik kayıpları, tekrarlayan implantasyon başarısızlıkları, kötü embriyo gelişimi öyküsü gibi problemleri olan çiftlerde erkeklerde sperm hücrelerinde anöploidi taraması yapılarak anomali oranları belirlenebilir. Yüksek oranda anöploid sperm taşıyan olguları belirlemek, çiftlere uygulanacak PGT uygulamaları ve embriyolarda kromozom incelemesi açısından önemlidir.

• Eğer erkek translokasyon taşıyıcısı ise spermlerde translokasyona katılan kromozomlara yönelik özel FISH işlemi uygulanabilir. Böylece spermlerin translokasyon yönünden anormal (dengesiz) olanlarının yüzdesi hesaplanabilir ve oluşacak embriyolardaki dengeli-dengesiz embriyo oranı hakkında önceden bilgi edinebilmek mümkün olabilir (Şekil 13). Sperm-FISH testi tüp bebek tedavisinde translokasyon yönünden normal veya dengeli embriyo bulunma olasılığını belirlemede yardımcı olmaktadır.
   

                                                       

                                           Şekil 13: Anormal (dengesiz) sperm görüntüsü. Normal veya Dengeli olan
                                               spermlerde her bir kromozom segmentinden birer adet sinyal olmalıdır,
                                     2 veya daha fazla sayılarda sinyal saptanan hücreler dengesiz olarak değerlendirilir.
 

Sperm-TUNNEL Testi Nedir, Kimlere Uygulanır?

Açıklanamayan infertilite, tekrarlayan gebelik kayıpları, tekrarlayan implantasyon başarısızlıkları, kötü embriyo gelişimi öyküsü gibi problemleri olan çiftlerde sperm hücrelerindeki DNA fragmantasyon (DNA hasarı) oranının belirlenmesi amacı ile kullanılır. Spermler DNA hasar oranına göre normal, kısmi hasarlı ve yüksek oranda hasarlı sperm örneği olarak 3 grupta değerlendirilir (Şekil 14). Sperm-TUNNEL testi tüp bebek tedavisinde klinisyenlere DNA hasarlı sperm hücrelerinin oranı hakkında bilgi vermesi bakımından önemlidir.
 

                                                    

                                                                 Şekil 14: Normal ve kısmi hasarlı sperm örnekleri

 

Prenatal/ Postnatal FISH Uygulamaları Nelerdir?

Günümüzde NIPT (non-invazif prenatal test) gibi yeni geliştirilen tekniklerle anneden alınan kan örneğinden sayısal olarak anöploidi incelemesi ve yapısal olarak delesyon/duplikasyon analizleri yapılabilmektedir. Ayrıca merkezimizde periferik kan, amniosentez, korion villüs biopsisi (CVS), kordosentez (KS), düşük tahliye materyali, doku biyopsisi gibi örneklerde FISH ile hızlı anöploidi incelemeleri ve Prader-Willi/Angelman Sendromu, Di George Sendromu, Williams Sendromu gibi mikrodelesyon sendromları için de tanı amaçlı FISH testleri yapılmaktadır.
 

PREİMPLANTASYON GENETİK TANIDA CGH ve MICROARRAYLER

1996 yılında blastomerlerde uygulanan CGH (Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon)  yöntemi, ilk kez bir hücrenin bütün kromozomlarının aynı anda incelenebilmesini sağlamıştır (Şekil 15). Bütün kromozom sayılarının incelenebilmesine ek olarak kromozomlardaki küçük kayıplar (delesyon) veya artışlar (duplikasyon) gibi yapısal bozuklukların incelenebilmesine de imkan tanımaktadır.

                           

                                              Şekil 15: Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon
                                                 (Comparative Genomik Hibridization - CGH)

 

CGH yönteminin preimplantasyon genetik tanıda kullanılmasının önündeki en büyük engel, yöntemin süresinin uzun olmasından dolayı (4-5 gün) IVF işleminin süresine uymamasıdır. Ancak bu sorunda, yumurtaların ilk toplandıkları gün, kutup cisimciklerinin incelenmesi ile veya biyopsi yapılan embriyonun sonuçlar elde edilene kadar dondurulması ve sonrasında transfer edilmesi ile giderilebilmektedir.
 

Preimplantasyon Genetik Taramada Mikroarrayler:

1996 yılında blastomerlerde uygulanan CGH (Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon)  yöntemi, ilk kez bir hücrenin bütün kromozomlarının aynı anda incelenebilmesini sağlamıştır. Bütün kromozom sayılarının incelenebilmesine ek olarak kromozomlardaki küçük kayıplar (delesyon) veya artışlar (duplikasyon) gibi yapısal bozuklukların incelenebilmesine de imkan tanımaktadır.

                      

                                                                Şekil 16: DNA mikroarray temel çalışma prensibi

DNA mikroarrayleri cam, plastik veya silikon gibi katı bir yüzeye tutturularak sıralı bir şekilde oluşturulmuş mikroskobik DNA dizi noktacıklarıdır. Bir mikroarrayde “probe” adı verilen bu noktacıklardan on binlerce bulunabilir. Bu sayede aynı anda kromozomlar üzerindeki birçok bölgenin incelenmesi mümkün olmaktadır.  Mikroarrayde kullanılan probe sayısı FISH ve CGH yönteminde kullanılabilen probe sayısına kıyasla daha fazla olduğu için mikroarrayler daha fazla bilgi verici olmaktadır. Ayrıca hibridizasyon süresinin daha kısa olması ve analiz sürecinin bilgisayar programları sayesinde daha otomatik bir şekilde yapılması sonucu kromozomlarla ilgili veriler 48 saatten daha kısa sürelerde elde edilebilmektedir (Şekil 16). 

Merkezimizde PGT işlemleri için 2011 – 2017 yılları arasında kullanılan aCGH (arrayCGH) tekniği yerini daha yeni ve gelişmiş bir yöntem olan NGS (Yeni Nesil Dizileme) tekniğine bırakmıştır. 

Detaylı Bilgi İçin Tıklayınız