Embriyolar 1. günden 6. güne kadar gelişimlerinin her aşamasında dondurulabilmektedir. Ancak çözme sonrası en yüksek sayıda canlı embriyo elde edilebilmesi için dondurma işleminin, embriyoların gelişim aşamasına özel bir teknikle uygulanması gerekmektedir.

Embriyo Dondurma İşlemleri (Vitrifikasyon)

Eylül 2017

Tüp bebek denemesinde gebelik elde edilememesi, gebelik elde edilip düşükle sonlanması ya da doğumla sonlanan bir gebelikten sonra çiftin tekrar bir bebek dünyaya getirmeye karar vermesi durumunda, daha önce kendi sperm ve yumurta hücrelerinin döllenmesiyle elde edilen ve dondurulan embriyoları çözülüp kadın rahmine yerleştirilerek gebelik sağlanabilir. Bu yöntemle kadına uzun süren hormon ilaçlarının verilmesi engellendiği gibi tüp bebek işlemindeki gerekli birçok aşama atlanacağı için maliyet bakımından da çiftlere kolaylık sağlamaktadır.

Embriyolar 1. günden 6. güne kadar gelişimlerinin her aşamasında dondurulabilmektedir. Ancak çözme sonrası en yüksek sayıda canlı embriyo elde edilebilmesi için dondurma işleminin, embriyoların gelişim aşamasına özel bir teknikle uygulanması gerekmektedir. Embriyo transferi sonrası kalan sağlıklı embriyoların dondurulması için, Türkiye’de ilk olarak merkezimizde gerçekleştirilen, başarısı klinik deneyler ile ispatlanmış olan embriyo vitrifikasyon, bir başka ifade ile camlaştırma, yöntemi kullanılmaktadır. Vitrifikasyon yönteminin en önemli özelliği, embriyoların yüksek yoğunluktaki koruyucu madde ile 3–4 dakika muamele edilir. Burada amaç hücreler içerisindeki su moleküllerinin, ozmotik dengelenme olarak adlandırılan kimyasal bir süreçle, hücre dışı kriyoprotektanlar kullanılarak dışarı çıkarılarak aynı anda yerine hücre içi kriyoprotektanların yerleştirilmesidir. Bu değişim dengelendiğinde, yani hücre içindeki su tamamen kriyoprotektanlar ile yer değiştirdiğinde, embriyolar direkt olarak -196⁰C ısıya sahip sıvı azota alınır. Bu işlem, dakikada eksi 2.000–20.000⁰C derece soğutma hızı ile embriyoların hasar görmeden dondurulabilmesine imkan sağlar. Klasik-yavaş embriyo dondurma yönteminin aksine, vitrifikasyon veya hızlı dondurma yöntemi ile, özellikle 3.ve 4.gün ve blastosist dediğimiz 5.ve 6 gün embriyoları çok daha başarılı bir şekilde dondurulmaktadır. Dondurma yönteminin başarısını gösteren en önemli kriterleden biri olan çözme sonrası embriyolardaki canlılık oranı, vitrifikasyon ile dondurulup çözülmüş olan embriyolarda neredeyse %100’e yakındır. Embriyo çözme sonrası yüksek canlılık oranına ilave olarak vitrifikasyon yöntemi, anne adaylarına tekrar ve yüksek gebelik şansı veren en başarılı dondurma yöntemidir.
Teknik olarak çok daha uzun süreler saklanabilmelerine rağmen, ülkemizde embriyoların dondurularak saklanma süresi Sağlık Bakanlığı Üremeye Yardımcı Teknikler Üst Kurulunun hazırladığı yönetmelik gereğince 5 yıl olarak sınırlanmıştır. Yine bu yönetmeliğe göre embriyo dondurma ve çözme işlemi ancak eşlerin yazılı onayıyla gerçekleştirilebilmekte, çiftin boşanması, eşlerden birinin ölümü veya saklama süresinin dolması durumunda saklanan embriyolar imha edilmektedir.

Kümülatif Gebelik

Kümülatif gebelik tanımı belirli bir zaman diliminde bir taze deneme ve bu denemede elde edilen embriyolarla yapılmış olan dondurma-çözme  siklusları sonrasında elde edilen toplam gebelik ve canlı doğum sayısını ifade eder. Merkezimizde yaptığımız gebelik hesaplamalarında elde edilen embriyo sayısına göre 4 kez denemeye gelen hastaların bir kez gelenlere oranla yaklaşık %30 daha fazla canlı doğuma ulaşabildiği görülmüştür. Ardışık çözme denemeleri sonrasında gebelik oranları %90, canlı doğum oranları ise %60'lara ulaşmıştır.
 

Blastosist Evresi Embriyo Vitrifikasyonu ve Çözme

Embriyo dondurma işlemi her ne kadar üç-dört yıl öncesine kadar tüp bebek tedavisi gören hastalarda embriyo transferi sonrası uygun kalitede olan ve geriye kalan embriyolara uygulanıyor olsa de günümüzde dondurma işlemi çoğunlukla taze transfer yapılmaksızın uygulanmaktadır. Embriyo gelişiminin beşinci ya da altıncı gününde blastosistlerin dondurulması (vitrifikasyon) kalitesi uygun olan blastosistlerin özel bir hazırlık işlemine tabi tutulduktan sonra sıvı azot içerisinde saklanmasıdır. Vitrifikasyon ya da camlaştırma yönteminin kullanılmasındaki en önemli iki neden:

Memorial Şişli Hastanesi Tüp Bebek Merkezi’nde vitrifikasyon:

OHSS yumurtalıklarında çok sayıda yumurta bulunan polikistik overli hastalarda, yumurtalıkların uyarıcı hormonal tedaviye aşırı yanıt vermeleri sonucunda gelişebilen çok riskli bir durumdur ve bu olgularda tüm embriyolar dondurulup, kadında hayati risk oluşturan bu tablonun gerilemesinden sonra daha emniyetli bir zamanda çözülerek transfer edilebilirler.

Embriyoların dondurulması çeşitli nedenlerden dolayı zorunlu olarak da yapılmaktadır. Rahim içi zarının (endometriyum) kalınlığının gebelik için yeterli olmaması, polip, myom gibi gebeliği etkileyebilecek patolojilerde ve tiroid vb. gibi hormon bozukluklarında embriyolar dondurularak saklanır. Gerekli tedaviler sonrasında transfer edilebilirler.

 

Embriyo dondurma (Vitrifikasyon) sırasında koruyucu kimyasallar ve kompleks şeker molekülleri su
moleküllerinin yerine geçerek, hücreleri donma sırasında oluşabilecek kristalizasyon hasarından korur.
 
Embriyo çözme sırasında su molekülleri hücre içine girerek embriyonun geriye hacim kazanmasını sağlar
 


 

Vitrifikasyon işleminde öncelikle koruyucu maddenin hücre içine girerek su molekülleri ile yer değiştirmesi sonrasında da hücre içerisinde kalan su moleküllerinin tamamen dışarı çıkarılarak embriyonun camlaştırılarak donması hedeflenir
 


PGT Amaçlı embriyoların biyopsi sonrası dondurulması

PGT yöntemi günümüze kadar çoğunlukla gebelik kaybı ve kısırlığa sebep olan kromozomal bozuklukların ortaya konulması ve tüp bebek tedavisindeki başarı şansının arttırılması amacıyla kullanılmıştır. Embriyolarda anöploidi taraması, özellikle anne adayının yaşının ileri olduğu durumlar, tekrarlayan başarısız tüp bebek denemeleri, tekrarlayan düşükler ve şiddetli erkek faktörü gibi endikasyonları olan çiftlerde tedavideki başarıyı arttırmak ve gebelik kayıplarını azaltmak amacıyla kullanılan bir yöntemdir. Ayrıca Tek-Gen hastalıkları ve HLA doku tiplemesi işlemleri için de PGT işlemi uygulanır.

Hatching evresine ulaşmış blastosistlerde iç hücre kitlesine müdahale etmeyecek şekilde embriyonun pozisyonu ayarlanır. Uçta bulunan trofektoderm hücrelerinden 6-8 tane koparılır. Embriyoda küçük bir hacim kaybı olur fakat yaklaşık 1-2 saat içerisinde embriyonun sahip olduğu yüksek rejenarasyon kapasitesi ile embriyo biyopsi öncesi morfolojisine ulaşır


Embriyoların blastosist evresine kadar başarılı bir şekilde kültüre edilmesi, elde edilen blastosistlere trofektoderm biyopsi işlemi uygulanır. Biyopsi işleminden sonra embriyodan alınan 6-8 hücre özel PCR tüplerine konularak genetik bölümüne gönderilir. Alınan hücreler iç hücre kitlesine ait olmadığı için embriyo gelişimine zarar vermez. Ayrıca hücre sayısının fazla olması tanının doğruluğu açısından önem taşır. Kromozomlarda anöploidi taraması dünyadaki en ileri tekniklerden biri olan Next Generation Sequencing (NGS) yöntemi ile yapılır. PGT sonrası embriyolar genetik değerlendirme süreci ve rahimin doğal bir döneme hazırlanması amacıyla dondurulur.

Dondurulmuş-çözülmüş embriyo transferlerinin başarısı taze denemeler kadar hatta daha yüksek olarak izlenmektedir. Bunun nedeni hormonal uygulamaların rahmin iç tabakasını yüksek estrojen ve progesteron hormonlarına maruz bırakması ve embriyonun tutunma şansının bu nedenle düşmesidir. Eğer kadının adet döngüsü düzenli ise olgular hiç hormon kullanmadan takip edilerek natürel siklusta transfer yapılmaktadır. Başarı oranlarımız doğrultusunda merkezimizde blastosist evresinde tek embriyo transferi ve kalan iyi kalite embriyoların dondurularak saklanması stratejisini uygulamaktayız. Vitrifikasyon ve çözme işlemleri, cryotop metodu ile yapılmaktadır.

DONDURULAN EMBRİYO, SPERM VE GONAD DOKULARININ SAKLANMASI

Biyolojik Materyaller uzun süreler sonra tekrar kullanılmak amacı ile depolanırlar.  Amaç depolama esnasında canlılık özelliği kaybetmemesidir. Dondurulmuş materyallerin hastalar tarafından tekrar kullanılabilmesi için uzun yıllar güvenli depolama tanklarında -196°C’de korunabilmesi gerekmektedir. Bu nedenle özel Vakum+Süper İnsülasyon Ceketi olan çelik tanklar kullanılmaktadır. Bilimsel araştırmalar arttıkça sıvı azot sıcaklığında dahi Hepatit gibi bazı virüslerin yaşadıkları tespit edilmiştir. Bu virüslerin bulunduğu örneklerin diğer örneklere sıvı azot aracılığı ile geçme riski de teorik olarak tespit edilmiştir. Buhar fazlı tanklar depolama amaçlı kullanıldığında kontaminasyon riski en aza indirilmiş olur. Merkezimizde kullandığımız buhar fazlı tankların bazı özellikleri;

 
Merkezimizde her biri 30.000’in üzerinde örnek depolayabilen iki adet buhar fazlı tank bulunmaktadır. Dar ağız açıklığı ısı kaybını önlerken çelik ve vakumlu dış yüzey yüksek izolasyon sağlar.
 

Buhar fazlı yüksek kapasiteli tanklarda üst üste iki kayar bölme içerisinde örnekler farklı düzeylerde saklanabilmektedir. Bölmenin iki katlı olması 30.000’in üzerinde örneğin saklanmasına olanak sağlar.
 

Viral enfeksiyon taşıyan örneklerin saklanması

Son yıllarda hepatit b, c ve HIV başta olmak üzere, bulaşma riski olan enfeksiyonlarda, tüp bebek işlemlerinde alınan güvenlik önlemleri ve bunları uygulama yöntemleri son derece gelişmiştir. Bu tür olgulara özel olarak ayrılmış bölümlerde, yüksek güvenlik standartlarında mikroenjeksiyon işlemleri yapılmaktadır.

Sperm hazırlığı çift tabakalı veya 3 tabakalı dansite gradient yöntemiyle yapılarak spermlerin virüslerden arındırılmasına çalışılır. Yıkama işlemi sonrasında örnek ikiye bölünür. Bir kısmı yüksek korumalı tüpler içinde (high security straw=HSS) dondurulurken diğer kısmı ise arındırma işleminin başarısını test etmek üzere biyokimya laboratuvarına gönderilir. İncelenme sonrası sperm örneğinin virüslerden arındırıldığı anlaşılınca dondurulan örnek çözülerek tüp bebek tedavisi için kullanılır.

Kadına ait viral enfeksiyon taşıyıcılığı durumlarında oositlerin yani yumurtaların denudasyon denilen kabuklarından temizlenmesi işlemi sırasında özellikle bol flushing (yıkama) yapılarak benzer bir arındırma işlemi yumurtalar için de yapılır. Gamet (sperm veya yumurta) veya embriyoların dondurulması alanında yeni geliştirilen teknoloji sayesinde dondurma sonrası örnekler farklı karantina tanklarında saklanarak bulaşma riski tamamen ortadan kaldırılabilmektedir. Yüksek güvenlikli tanklarda birbirleriyle teması mümkün olmayan ayrı bölümlerde dondurma ve saklama işlemi yapılmaktadır. Merkezimizde Hepatit B, Hepatit C ve HIV virüsü taşıyıcıları için farklı karantina ve saklama tankları bulunmaktadır.