EMBRİYO DONDURULMASI (VİTRİFİKASYON)

Dondurulmuş embriyo transferi farklı nedenlere yapılmaktadır; tüp bebek denemesinde transfer edilen embriyo ile gebelik elde edilememesi, tüp bebek tedavisi ile gebelik elde edilip düşükle sonlanması, doğumla sonlanan bir tüp bebek gebeliğinden sonra çiftin tekrar bir bebek dünyaya getirmeye karar vermesi, embriyolara uygulanmış genetik analiz (PGT) işleminin sonuçlanması gibi durumlarda daha önce kendi sperm ve yumurta hücrelerinin döllenmesiyle elde edilen ve dondurulan embriyolar çözülüp kadın rahmine yerleştirilerek gebelik sağlanabilir.

Embriyo dondurma yöntemi tekrar tüp bebek tedavisi yapılmasını engellendiği için maliyet bakımından da çiftlere kolaylık sağlamaktadır.

Embriyolar 1. günden 6. güne kadar gelişimlerinin her aşamasında dondurulabilmektedir. Ancak çözme sonrası en yüksek sayıda canlı embriyo elde edilebilmesi için dondurma işleminin, embriyoların gelişim aşamasına özel bir teknikle uygulanması gerekmektedir. Embriyo transferi sonrası kalan sağlıklı embriyoların dondurulması için, Türkiye’de ilk olarak merkezimizde gerçekleştirilen, başarısı klinik deneyler ile ispatlanmış olan embriyo vitrifikasyon, bir başka ifade ile camsılaştırma, yöntemi kullanılmaktadır. Vitrifikasyon yönteminin en önemli özelliği, embriyoların yüksek yoğunluktaki koruyucu madde ile 3–4 dakika muamele edilir. Burada amaç hücreler içerisindeki su moleküllerinin, ozmotik dengelenme olarak adlandırılan kimyasal bir süreçle, hücre dışı kriyoprotektanlar kullanılarak dışarı çıkarılarak aynı anda yerine hücre içi kriyoprotektanların yerleştirilmesidir. Bu değişim dengelendiğinde, yani hücre içindeki su tamamen kriyoprotektanlar ile yer değiştirdiğinde, embriyolar direkt olarak -196⁰C ısıya sahip sıvı azota alınır. Bu işlem, dakikada eksi 2.000–20.000⁰C derece soğutma hızı ile embriyoların hasar görmeden dondurulabilmesine imkan sağlar. Klasik-yavaş embriyo dondurma yönteminin aksine, vitrifikasyon veya hızlı dondurma yöntemi ile, özellikle 3.ve 4.gün ve blastosist dediğimiz 5.ve 6 gün embriyoları çok daha başarılı bir şekilde dondurulmaktadır. Dondurma yönteminin başarısını gösteren en önemli kriterleden biri olan çözme sonrası embriyolardaki canlılık oranı, vitrifikasyon ile dondurulup çözülmüş olan embriyolarda neredeyse %100’e yakındır. Embriyo çözme sonrası yüksek canlılık oranına ilave olarak vitrifikasyon yöntemi, anne adaylarına tekrar ve yüksek gebelik şansı veren en başarılı dondurma yöntemidir.

Teknik olarak çok daha uzun süreler saklanması mümkün olmakla birlikte, ülkemizde embriyoların dondurularak saklanma süresi Sağlık Bakanlığı Üremeye Yardımcı Teknikler Üst Kurulunun hazırladığı yönetmelik gereğince 5 yıl olarak sınırlandırılmıştır. Daha uzun saklama süreleri Sağlık Bakanlığı tarafından değerlendirilmektedir.

Yönetmeliğe göre embriyo dondurma ve çözme işlemi ancak eşlerin yazılı onayıyla gerçekleştirilebilmekte, çiftin boşanması, eşlerden birinin ölümü veya saklama süresinin dolması durumlarında dondurulmuş embriyolar imha edilmektedir.

Kümülatif Gebelik

Kümülatif gebelik tanımı belirli bir zaman diliminde bir taze deneme ve bu denemede elde edilen embriyolarla yapılmış olan dondurma-çözme  siklusları sonrasında elde edilen toplam gebelik ve canlı doğum sayısını ifade eder. Merkezimizde yaptığımız gebelik hesaplamalarında elde edilen embriyo sayısına göre 4 kez denemeye gelen hastaların bir kez gelenlere oranla yaklaşık %30 daha fazla canlı doğuma ulaşabildiği görülmüştür. Ardışık çözme denemeleri sonrasında gebelik oranları %90, canlı doğum oranları ise %60'lara ulaşmıştır.

 

Blastosist Evresi Embriyo Vitrifikasyonu ve Çözme İşlemi

Embriyo gelişiminin beşinci ya da altıncı gününde blastosistlerin dondurulması kalitesi uygun olan blastosistlerin özel bir hazırlık işlemine tabi tutulduktan sonra sıvı azot içerisinde saklanmasıdır. Vitrifikasyon ya da camsılaştırma yönteminin kullanılmasındaki en önemli iki neden:

Memorial Şişli Hastanesi Tüp Bebek Merkezi’nde vitrifikasyon şu durumlarda yapılmaktadır:

OHSS yumurtalıklarında çok sayıda yumurta bulunan polikistik overli hastalarda uyarıcı hormonal tedaviye aşırı yanıt sonucunda gelişebilen çok riskli bir durumdur. Bu olgularda tüm embriyolar dondurulup, kadında hayati risk oluşturan OHSS tablosunun gerilemesinden sonra daha emniyetli bir dönemde çözülerek transfer edilebilirler. Yukarda bahsedilen dondurma nedenleri içinde en önemlisi yaşam tehdit eden OHSS’dan koruma amaçlı dondurma yapılmasıdır.   

Embriyo dondurma (Vitrifikasyon) sırasında koruyucu
kimyasallar ve kompleks şeker molekülleri su moleküllerinin 
yerine geçerek, hücreleri donma sırasında oluşabilecek
kristalizasyon hasarından korur.

Embriyo çözme sırasında su molekülleri hücre içine
girerek embriyonun geriye hacim kazanmasını sağlar.

  Vitrifikasyon işleminde öncelikle koruyucu maddenin hücre içine girerek
  su molekülleri ile yer değiştirmesi sonrasında da hücre içerisinde kalan
  su moleküllerinin tamamen dışarı çıkarılarak embriyonun
  camsılaştırılarak donması hedeflenir.

 

Preimplantasyon Genetik Tanı amaçlı embriyo dondurma

PGT yöntemi embriyolarda kromozom bozukluğunun saptanması amacı ile kullanılmaktadır. Tüp bebek ile elde edilen embriyoların yaklaşık yarısı anne adayının yaşına bakmaksızın kromozom bozukluğu taşımaktadır. Anne adayının yaşının ileri olması durumunda ise bozukluk oranı dramatik artış göstermektedir. Özellikle ileri yaş durumunda kullanılan bu teknik ayrıca tekrarlayan başarısız tüp bebek denemeleri, tekrarlayan erken düşükler ve kromozom testinde bozukluk saptanan çiftlerde başarıyı arttırmak ve gebelik kayıplarını azaltmak amacıyla kullanılmaktadır. Ayrıca tek-gene bağlı geçiş gösteren genetik hastalıklar ve HLA doku tiplemesi işlemleri için de kullanılmaktadır. Bu teknikte embriyoların dondurulmasının amacı yapılacak ileri genetik testler için zaman sağlanmasıdır.

Hatching evresine ulaşmış blastosistlerde iç hücre kitlesine müdahale etmeyecek şekilde embriyonun pozisyonu ayarlanır. Uçta bulunan trofektoderm hücrelerinden 6-8 tane koparılır. Embriyoda küçük bir hacim kaybı olur fakat yaklaşık 1-2 saat içerisinde embriyonun sahip olduğu yüksek rejenarasyon kapasitesi ile embriyo biyopsi öncesi morfolojisine ulaşır.

 

OOSİT (YUMURTA) DONDURULMASI

Yumurta hücresi insan vücudundaki en büyük hücre olması nedeniyle içerisinde çok miktarda su molekülü barındırır. Donma sırasında su moleküllerinin kristalleşmesi, kromozom dağılımın bozulmasına ve hücre bölünmesine yön veren mikroflament denilen iskelet yapının hasar görmesine yol açabilir. Bu durumda çözme işlemi sonrası oositin canlılığı ve embriyo gelişimi olumsuz yönde etkilenebilir. Özellikle son yıllarda, kristalleşmeyi azaltan vitrifikasyon yönteminin kullanımı ve bu amaçla kullanılan solüsyon ve protokollerdeki iyileşmelerle oositin kromozom dağılımı ve iskelet yapısı korunmaktadır. Dondurulmuş oositlerle yapılan denemelerle, taze denemelere benzer sonuçlar elde etmek mümkün olmaktadır. Ülkemizde oosit dondurma-çözme işlemi sonrası rapor edilen ilk gebelik ve canlı doğum merkezimiz tarafından gerçekleştirilmiş olup uluslararası literatürde yayınlanmıştır.

Oosit vitrifikasyonu, kadının sınırlı sayıda oosit rezervine sahip olması ve oosit kalitesinin yaşın artışına bağlı olarak düşüş göstermesi nedeniyle, fertilitenin korunması bakımından ayrı bir öneme sahiptir.

Oosit dondurma işleminde, öncelikle hastaya, tüp bebek tedavisinde uygulandığı şekilde, kontrollü ovülasyon indüksiyonu uygulanarak elde edilecek oosit sayısının arttırılması gerekmektedir. Toplanan oositler 2 saat sonra dondurma öncesi hazırlık işlemlerinin ardından, özel vitrifikasyon kiti ve dondurma protokolü kullanılarak dondurulur,  -196°C’de saklanır.

Oosit Dondurma Endikasyonları

Sosyal amaçlı dondurulan oositler ile ilgili yönetmelikte en fazla 5 sene saklanabilmektedir ancak Sağlık Bakanlığı’na dilekçe ile uzatma talebinin iletilmesi halinde bu sürenin uzatılabileceği ilgili yönetmelikte belirtilmektedir.

2010 yılına kadar yumurta dondurması yöntemi ile tüm dünyada rapor edilen canlı doğum sayısı 50 civarında iken. Özel vitrifikasyon teknikleri ve cryotop sisteminin kullanılmaya başlanmasıyla günümüzde yüksek gebelik oranları elde edilebilmektedir. Yapılan çalışmalarda transfer edilen vaka başına %50’ye varan canlı doğum oranları elde edilmiştir.

 

Sperm Hücrelerinin Dondurulması

Sperm hücreleri yumurta hücresi ile karşılaştırıldığında yaklaşık 500 kat daha küçük olduğu için dondurma çözme başarısı spermlerde göreceli olarak daha yüksektir. Dondurma işleminde özel olarak üretilmiş “egg-yolk buffer ve gliserol” gibi kriyoprotektan adı verilen koruyucu solüsyonlar kullanılır. Yumurta hücresi ve embriyoda olduğu gibi hücre içi buz kristali oluşumunu engellemek için dondurma işlemi sırasında sperm içindeki su moleküllerinin uzaklaştırılıp kriyoprotektanın hücre içine alınması sağlanır. Dondurulan spermler sıvı azot tankları içerisinde (-196°C) saklanır. Dondurulmuş spermlerin çözülmesi sırasında kriyoprotektan hücre dışına çıkarılır ve hücre içine suyun geri alınması sağlanır. Sperm dondurma işleminin başarısı hemen daima spermlerin ne kadar iyi kalitede olup olmadığı ile alakalıdır. Ejakülattaki sperm sayı, hareketlilik ve morfolojik yapısı ne kadar iyi ise çözme sonrası canlılık oranı o kadar yüksek olmaktadır. Çok şiddetli sayı ve hareket azlığı gösteren spermlerin dondurma işlemine dayanıklılığı genellikle daha düşük olmaktadır. Dondurma öncesi sperm özellikleri dikkate alınarak olguların bu yönde doğru bilgilendirilmeleri ve çözme sonrası riskli olabileceği iyi anlatılmalıdır.

Testiküler sperm alınması (TESE) gerekli olan azospermik erkeklerde TESE işlemi eşlerden yumurtalarının toplanacağı gün yapılmakta ve kullanılanlardan arta kalan testiküler spermler dondurulmaktadır. Sperm bulma ihtimalinin çok az olduğu olgularda ise kadın hazırlanmadan direkt olarak tanısal biyopsi yapılarak sperm varlığı araştırılmaktadır. Bu vakalarda sperm elde etmek amacıyla yapılan işlemler fizyolojik, psikolojik ve maddi yükler getirmektedir. Mikroenjeksiyon işleminden sonra kalan testis spermleri sayı ve kalite olarak dondurma için yeterli ise olası sonraki uygulamalarda kullanılmak amacı ile dondurulmaktadır. Testisten elde edilen spermlerin sayı ve kalitesi kötü ise çözüldüklerinde uygun sperm bulma olasılığı azalmaktadır. Testis spermlerinin kalitesine göre olgular çözme sonrası olası durum için mutlaka bilgilendirilmedir.

Sperm dondurma hangi durumlarda yapılıyor?

 

Testis Dokusunun Dondurulması

Özellikle Mikro-TESE işlemi ile elde edilmiş testis dokusunda sperm var ise bu dokunun atılması yerine kişinin kendisine ait olan hücrelerin dondurulması sağlanır. Böylece kişi ileri bir tarihte yeni bir tedaviye başlamak isterse tekrar ameliyat geçirmek zorunda kalmamakta ve dondurulan bu doku içerisindeki spermler kullanılabilmektedir.

Testis dokusu dondurma işlemi sırasında testis dokusu özel sıvılar içerisinde mekanik olarak homojenize edilir. Bu işlem sonrasında kriyoprotektan ile muamele edilerek yüksek koruma özelliğine sahip tüpler içerisinde (HSS = High Security Straw) dondurma işlemi yapılır. Kullanılan tüpler inört yapıda olup iyonomedik reçineden üretilmiştir ve biyolojik olarak dondurulan hücrelere zarar vermeyecek şekilde tasarlanmıştır. Bu tüpler soğuma sırasında sıvıların oluşturacağı yüksek basınca (150kg/cm2) dayanıklıdır. Dondurulan örnekler -196°C’de buhar fazında azot içeren özel tanklarda saklanır. 

Dondurma sırasında testis dokusu özel solüsyonlar içerisinde homojenize edilir.
Daha sonra dondurma solüsyonu çok yavaş bir şekilde
örneğe eklenerek karıştırma işlemine devam edilir.
Yeterli süre belendikten sonra örnek tüplere yüklenir. Tüplerin
her iki ucu ısı ile kapatılarak yüksek kuruma ve izolasyon sağlanır.

 

OVER DOKUSU DONDURULMASI VE TRANSPLANTASYONU

Günümüzde, gelişen tedavi yöntemleri ile birçok kanser türünde kür sağlanabilmektedir. Bu sevindirici ilerlemelere rağmen bu tür tedaviler sonrasında birçok genç kadın hayatının geri kalan kısmını infertil olarak geçirmekte ve erken dönemde menopoz sorunu ile karşı karşıya kalmaktadır. Aynı problem çocukluk yaşı tümörleri, rahim kanseri gibi erken yaşta herhangi bir nedenle yumurtalıkları ameliyat ile alınmış kadınlar için de geçerli olmaktadır. Böyle durumlarda, yumurtalıkların veya yumurtalıklardan alınan bir parçanın, çeşitli koruyucu maddeler içerisinde dondurularak saklanması işlemi merkezimizde uygulanmaktadır. Laparoskopi cerrahisi esnasında alınan over dokusunun bir kısmı ya da tamamı laboratuvara getirilir. Önceden hazırlanmış özel solüsyonlar içinde oositleri (yumurta) içeren korteks dokusu overin iç kısmından ayrılır. Daha sonra yaklaşık 1cm’lik şeritler halinde kesilir. Elde edilen küçük parçalar, içinde dondurma solüsyonu olan özel tüplere konularak dondurma cihazına yüklenir.  İşlemde yumurtaları içeren yüzey dokusu (Korteks), küçük parçalar halinde dondurularak saklanır. Dondurulan dokular daha sonra çözülerek kullanılmak üzere -196°C‘de sıvı azot tanklarında saklanır. Over dokusunun dondurulup çözüldükten sonra tekrar vücuda yerleştirildiğinde, fonksiyonlarını koruduğu gözlenmiştir. Bu amaçla dondurulup çözülen dokular laparoskopik olarak yumurtalığın alt bölgesinde periton (karın) zarında açılan cebe yerleştirilir. Bu yöntem yumurtalık kapasitesini erken yaşta kaybetme riski ile karşı karşıya kalan özellikle yumurta dondurma için uygun olmayan kız çocukları ve kanser tedavisine çok acil başlanması durumunda önerilmektedir.

Over dokusu dondurma işlemleri. İlk resimde overin laparoskopik cerrahi ile alınması gösterilmektedir. Daha sonra laboratuvara getirilen örnek hazırlanan özel solüsyonlar içerisinde küçük parçalara ayrılır. Ayrılma işlemi bitiminde örnekler tüplere konulur ve dondurma cihazına yüklenir.

Dondurulan over dokusu parçaları çözme işleminden sonra ameliyathaneye getirilir ve periton (karın zarında) açılan ceplere laparoskopik olarak yerleştirilir.

Over dokusunun saklandığı
özel tüpler (cryo vial)

Oositlerin Kümülüs Hücrelerinin Dondurulması

Kümülüs hücreleri oositi çevreleyen ve koruyan, destekleyen, besin ve enerji sağlayan ve oosit ile karşılıklı etkileşimde bulunarak oosit hakkında çok önemli bilgiler veren milyonlarca hücreden oluşan bir kümedir. Mikroenjeksiyon işlemi yapılırken oosite kolay ulaşabilmek için kümülüs hücreleri yumurta hücresinden ayrıştırılır. Bu hücreler dolaylı olarak oosit hakkında bilgi vermektedir, oosite ait kümülüs hücreleri hangi oositin en kaliteli olduğu hakkında bilgi verebilir. Çalışmalar kümülüs hücrelerinin gen aktiviteleri incelenerek oosit hakkında daha ileri bilgi edinilmesinin mümkün olduğunu göstermektedir. Merkezimizde de Uluslararası ödül alan bu proje kapsamında kümülüs hücrelerinin incelenerek her bir oositten gelişen embriyonun blastosiste ulaşabilme kapasitesinin incelenmesi çalışması yapılmaktadır. Bu çalışmaların yakın gelecekte en baştan hangi oositin iyi embriyo geliştireceği konusunda yol göstermesi mümkündür.

DONDURULAN EMBRİYO, SPERM VE GONAD DOKULARININ SAKLANMASI

Biyolojik Materyaller uzun süreler sonra tekrar kullanılmak amacı ile depolanırlar.  Amaç depolama esnasında canlılık özelliği kaybetmemesidir. Dondurulmuş materyallerin hastalar tarafından tekrar kullanılabilmesi için uzun yıllar güvenli depolama tanklarında -196°C’de korunabilmesi gerekmektedir. Bu nedenle özel Vakum+Süper İnsülasyon Ceketi olan çelik tanklar kullanılmaktadır. Bilimsel araştırmalar arttıkça sıvı azot sıcaklığında dahi Hepatit gibi bazı virüslerin yaşadıkları tespit edilmiştir. Bu virüslerin bulunduğu örneklerin diğer örneklere sıvı azot aracılığı ile geçme riski de teorik olarak tespit edilmiştir. Buhar fazlı tanklar depolama amaçlı kullanıldığında kontaminasyon riski en aza indirilmiş olur. Merkezimizde kullandığımız buhar fazlı tankların bazı özellikleri;

Depolama tanklarının özelliklerine ek olarak mevcut tankların ısısı Boomerang eksternal kalite kontrol sistemi ile dışarıdan ikincil olarak ölçülerek örneklerin tamamen emniyetli bir şekilde saklanması sağlanır.

Merkezimizde her biri 30.000’in üzerinde örnek depolayabilen iki adet buhar fazlı tank bulunmaktadır. Dar ağız açıklığı ısı kaybını önlerken çelik ve vakumlu dış yüzey yüksek izolasyon sağlar.

Buhar fazlı yüksek kapasiteli tanklarda üst üste iki kayar bölme içerisinde örnekler farklı düzeylerde saklanabilmektedir. Bölmenin iki katlı olması 30.000’in üzerinde örneğin saklanmasına olanak sağlar.

 

Viral enfeksiyon taşıyan örneklerin saklanması

Son yıllarda hepatit B, C ve HIV başta olmak üzere, bulaşma riski olan enfeksiyonlarda, tüp bebek işlemlerinde alınan güvenlik önlemleri ve bunları uygulama yöntemleri son derece gelişmiştir. Bu tür olgulara özel olarak ayrılmış bölümlerde, yüksek güvenlik standartlarında mikroenjeksiyon işlemleri yapılmaktadır.

Sperm hazırlığı çift tabakalı veya 3 tabakalı dansite gradient yöntemiyle yapılarak spermlerin virüslerden arındırılmasına çalışılır. Yıkama işlemi sonrasında örnek ikiye bölünür. Bir kısmı yüksek korumalı tüpler içinde (high security straw=HSS) dondurulurken diğer kısmı ise arındırma işleminin başarısını test etmek üzere biyokimya laboratuvarına gönderilir. İncelenme sonrası sperm örneğinin virüslerden arındırıldığı anlaşılınca dondurulan örnek çözülerek tüp bebek tedavisi için kullanılır.

Kadına ait viral enfeksiyon taşıyıcılığı durumlarında oositlerin yani yumurtaların denudasyon denilen (yumurta zarı çevresindeki hücreler temizlenmesi) işlemi sırasında özel kültür sıvıları ile ardışık yıkama yapılarak virüslerden arındırma yapılması amaçlanır. Gamet (sperm veya yumurta) veya embriyoların dondurulması alanında yeni geliştirilen teknoloji sayesinde dondurma sonrası örnekler farklı karantina tanklarında saklanarak bulaşma riski tamamen ortadan kaldırılabilmektedir. Yüksek güvenlikli tanklarda birbirleriyle teması mümkün olmayan ayrı bölümlerde dondurma ve saklama işlemi yapılmaktadır. Merkezimizde Hepatit B, Hepatit C ve HIV virüsü taşıyıcıları için farklı karantina ve saklama tankları bulunmaktadır.

Hasta Güvenliği

Laboratuvarlarımızda hasta güvenliği ve dondurulmuş örneklerin karışmasını engellemek için tüm aşamaları elektronik olarak kontrol eden radyofrekans tabanlı RI Witness sistemi kullanılmaktadır. Hastalara ait embriyo, doku ve hücrelerin dondurulması işlemlerinde -200 C ye dayanıklı özel üretilmiş barkodlar kullanılarak dondurulan örnekler güvenle saklanır.